即时聚合酶链式反应
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即时聚合酶链式反应（英语：Real-time polymerase chain reaction）是一种在DNA扩增反应中，以萤光染剂侦测每次聚合酶链锁反应（PCR）循环后产物总量的方法[1]。
此实验法已被众多科学家采用，因为其侦测范围广、灵敏度高、准确、专一及快速。PCR的发展因为侦测感染病患的病毒（不过RNA病毒须先反转录成DNA才进行PCR）或细菌量、癌症监测、诊断个别基因差异的用药反应等应用而大幅提高。
PCR的方法是基于侦测目标物在反应前及PCR后产物的量化关系，越早探测到指定萤光值表示目标基因组越多。相对于终端PCR方式（end-point PCR，传统的PCR配合凝胶电泳，在反应后侦测），qPCR（定量即时聚合酶链式反应）有许多优点。其结果可以较快取得且稳定，因为是采用非常敏感的化学萤光，而且不需要再继续处理PCR反应后的侦测，花费时间与精神的工作步骤便可以省下。此外，因为反应后不需打开管子而减少了操作污染。qPCR分析亦适于更具挑战性的应用，如多重侦测与高通量分析。
染剂
[编辑]使用于PCR侦测的化学物基本可分为两类：非专一性化学物，通常是与DNA结合的萤光染剂；目标专一性化学物，是使用萤光探针或引子。
- 目标专一性侦测：TaqMan probe （页面存档备份，存于互联网档案馆）、Molecular Beacon （页面存档备份，存于互联网档案馆）、LightUp、FRET （页面存档备份，存于互联网档案馆）(Fluorescence Resonance Energy Transfer)
- TaqMan probe 是选取PCR上下游引物之间的一段序列作为探针，并在探针的5`-端标记上荧光基团，3`-端标记上相应的淬灭基团(由于两个基团靠得很近，构成荧光能量传递的关系，没有荧光信号产生，在每一个循环的黏合(annealing （页面存档备份，存于互联网档案馆）)过程中，该探针可以与模板相结合，随后的延伸反应中，当引物合成至探针与模板结合处时，Taq酶的5`-外切酶活性可以降解探针的5`-端，并因此使荧光基团与淬灭基团分离，释放荧光，理论上每合成一次新链就有一次荧光信号释放)。
- Molecular Beacon 是探针片段在游离状态下呈茎环(stem-loop)结构，其中茎的部分一般是5至7个高GC含量的核苷酸，环的部分是15至30个可以与PCR模板互补的核苷酸序列，而且探针的5`-端和3`-端分别标记有荧光报告基团和淬灭基团(由于这两个基团处于茎的结构中，靠得很近，没有荧光信号产生，在PCR每一个循环的变性过程中，处于茎环结构的探针被打开，并在黏合过程中与模板结合，使萤光基团远离淬灭基团并释放荧光信号，因而荧光强度与被扩增的模板量成正比)。
仪器
[编辑]- 光源：氙气灯、雷射、发光二极体（LED）
- 滤镜
- 侦测方式：光电倍增管（photomultiplier tube, PMT）、光电耦合元件（charge-coupled device, CCD）、光电二极体（photodiodes）
- 控温方式：热电效应元件（peltier elements）、旋转式气流升降温、微流体式
- 容器：聚丙烯（PP）容器、玻璃毛细管
数据分析
[编辑]- 门槛循环（MIQE中定义为Cq值(quantification cycle)；过去通称为Ct, Threshold cycle，Ct值，又称阈值循环数）
- 解离曲线分析（melting curve）
- 高解析度解离分析（High Resolution Melt, HRM）
- FRET分析
应用
[编辑]PCR的一些应用包括：
1.基因表现分析：例如结核分岔杆菌（Mycobacterium tuberculosis）是一种生长相当缓慢的细菌，传统培养及鉴定一般需要花数周时间，但2015年时Watanabe Pinhata和Cergole-Novella以自己发展的real time PCR检测mpt64，直接检测病人痰液中的结核分岔杆菌，分析715个检体657个病人，其检测灵敏度（sensitivity）及特异性（specificity）分别为90.3%及98.6%，而传统培养方法的灵敏度及特异性分别为90.3%及99.7%。整个实验流程可以在5个小时内完成，此方法可以用于没有套装试剂（kit）可以使用的实验室[2]。
2.检验生物晶片的结果、
4.基因型鉴定
5.饮食分析
6.兽医微生物检测
qPCR的特点
[编辑]- 荧光实时定量PCR的基本原理有两个要点：首先是对PCR反应中的每一个循环的反应产物进行实时检测并记录下来；其次，用于检测PCR产物实时检测的荧光染料标记在一段可以与单链PCR产物(模板)特异性杂交的探针上，并且处于淬灭状态，只有当探针与模板特异性结合以后才有可能释放出荧光信号。
- 每一轮循环中PCR的产出量都以荧光信号的形式被PCR仪的光学检测系统记录下来，在某一循环中荧光信号的强度达到预先设定的阈值时，此时的循环数称为CT(Threshold Cycle)，Ct值与起始的模板量成反比，起始的核酸量越多，达到阈值的循环数就越少，换句话说CT值会越小。如果要确定量的话，需要做出标准曲线，以Ct值为纵坐标，起始模板数为横坐标作图。在新的MIQE规范中Ct这个惯用的名词被重新定义为Cq值(quantification cycle)。
和PCR比较
[编辑]- 常规PCR的产物在理论上呈指数级增长，而在实际反应中，由于反应物浓度、酶活性等条件的变化，在循环数不断增加时，反应进入平台期，PCR产物不再呈指数级增长。荧光实时定量PCR的优点在于它避免了常规PCR的平台效应对起始模板量和最终产物量之间相关性的干扰。
- 专一性探针的优点是只有正确的扩增产物才能和用于定量的探针结合并产生荧光信号，这样就避免了假阳性污染，对于临床诊断等工作特别有效。但相对来说，合成萤光探针的价格较于昂贵，不利于小规模的实验检测；因此在研究型实验室还是以SYBR Green的非专一型qPCR为主要选择。
普及性
[编辑]- 因为价格、耗材较贵的因素，qPCR多了光学配件及萤光物质的费用，在普及度上qPCR的机器较PCR机台少。
参考文献
[编辑]- ^ Higuchi et al., 1992
- ^ {吴俊忠、吴雪霞、周以正、周如文、胡文熙、洪贵香、孙培伦等十七人. 临床微生物学 细菌与霉菌学 第七版第一次印刷.台北市: 五南图书出版股份有限公司.2019年10月: 357. ISBN 978-957-763-609-6}
- ^ 名称：Real-time PCR概论 ,(搜寻名称就可找到此PDF档)
参考文献
[编辑]- Elyse; Houde, Alain. La PCR en temps réel: principes et applications (PDF). Reviews in Biology and Biotechnology. 2002, 2 (2): 2–11 [2015-12-13]. （原始内容 (PDF)存档于2009-06-12）.
- Bustin, SA. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. J Mol Endocrinol. 2000, 25 (2): 169–93. PMID 11013345. doi:10.1677/jme.0.0250169.
- Higuchi, R.; Dollinger, G.; Walsh, P.S.; Griffith, R. Simultaneous amplification and detection of specific DNA-sequences. Bio-Technology. 1992, 10 (4): 413–417 [2015-12-13]. doi:10.1038/nbt0492-413. （原始内容存档于2016-03-06）.
- Holland, P.M.; Abramson, R.D.; Watson, R.; Gelfand, D.H. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 50 !30 exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991, 88 (16): 7276–7280. JSTOR 2357665.
- Kubista, M; Andrade, JM; Bengtsson, M; Forootan, A; Jonak, J; Lind, K; Sindelka, R; Sjoback, R; Sjogreen, B; Strombom, L; Stahlberg, A; Zoric, N. The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med. 2006, 27 (2-3): 95–125. PMID 16460794. doi:10.1016/j.mam.2005.12.007.
- Higuchi, R.; Fockler, C.; Dollinger, G.; Watson, R. Kinetic PCR: Real time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology. 1993, 11: 1026–1030. doi:10.1038/nbt0993-1026.
- Filion, M. (2012). "Quantitative Real-time PCR in Applied Microbiology." Caister Academic Press. ISBN 978-1-908230-01-0 （页面存档备份，存于互联网档案馆）
- Wawrik, B; Paul, JH; Tabita, FR. Real-time PCR quantification of rbcL (ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase) mRNA in diatoms and pelagophytes. Appl. Environ. Microbiol. 2002, 68: 3771–3779. doi:10.1128/aem.68.8.3771-3779.2002.
- Logan J, Edwards K, Saunders N (editors). Real-Time PCR: Current Technology and Applications. Caister Academic Press. 2009. ISBN 978-1-904455-39-4.
