流式細胞術
 | 此條目需要精通或熟悉相關主題的編者參與及協助編輯。 (2015年12月14日) |
流式細胞術（flow cytometry，FC，FCM）是用於對懸液中細胞、微生物或細胞器等進行單個快速識別、多參數定量分析和分選的技術。此技術使用流式細胞儀（flow cytometer）自動化地從混合的生物材料中分離和分析細胞、細胞器或生物大分子。
流式細胞術可對流過光學或電子檢測器的生物粒子，檢測標記的熒光信號，實現高速、逐一、連續的細胞分析。
原理
[編輯]一束單色光（通常是激光）照到流體力學聚焦的一股流體上。若干個檢測器瞄向流束和激光相交的這個點，其中一個和激光在同一直線上（稱作前散射(FSC)），其它幾個和激光垂直（旁散射(SSC)和一個或幾個熒光監測器）。當每個懸浮顆粒通過光束時會按某種方式把光散射，同時所帶有的熒光化合物被激發並發射出頻率低於激發光的熒光。這些散射光和熒光的組合數據被檢測器記錄，根據各檢測器亮度的波動（每個細胞會顯出一個散射或熒光的峰）就能夠推算出每個顆粒的物理和化學性質。前散射與細胞體積相關，而旁散射取決於顆粒的內部複雜程度（比如核的形狀、胞質內顆粒的種類或者膜的粗糙程度），至於熒光則用來標記和檢測特定的細胞表面抗原或者DNA。
可以檢測的參數有：
- 細胞的體積和形態複雜程度
- 細胞中的色素
- DNA（細胞周期分析[1][2]、細胞動力學、細胞增殖等）
- RNA
- 染色體分析和分選（文庫構建、染色體塗染）
- 蛋白質
- 細胞表面抗原（CD標記）
- 胞內抗原（各種細胞因子(cytokine)、次級媒介等）
- 核抗原
- 酶活性
- pH，胞內離子化的鈣、鎂，膜電勢
- 膜流動性
- 細胞凋亡(apoptosis)
- 定量檢測DNA降解
- 粒腺體膜電位通透性變化
- 細胞膜上不對稱性的瓦解
- 細胞凋亡蛋白質活性偵測（caspase activity）
- 細胞存活能力
- 監測細胞電通透性
- 氧爆作用(oxidative burst)
- 研究癌細胞中的多重耐藥性（multi-drug resistance, MDR）
- 穀胱甘肽
- 各種組合（DNA/表面抗原等等）
這個列表非常長，而且在不斷地擴展。
流式細胞儀
[編輯]
流式細胞儀又稱熒光激活細胞分選器、熒光活化細胞分類計（FACS，Fluorescence Activated Cell Sorter）。
現代的流式細胞儀每秒可以實時檢測幾千個顆粒，並且可以主動分離具有不同特性的顆粒。
流式細胞儀和顯微鏡比較像，但能夠對大量的單個細胞利用一組參數進行高通量的自動量化。固體組織需要在檢測前製備成單細胞的懸浮液。
一個流式細胞儀包括五個組成部分：
- 細胞流動系統：液流（鞘液(sheath fluid)）攜帶細胞，使顆粒以串流形式逐個通過光束。
- 光源：有通常的燈（汞或氙）、高功率水冷的激光源（氬、氪、染料激光）、低功率氣冷激光（氬(488nm)，紅氦氖(633nm)，綠氦氖，氦鎘(紫外)）、激光二極管或激光二極管倍頻（藍、綠、紅、紫）。
- 檢測和模數轉換(analogue-to-digital conversion, ADC)系統：產生前散射、旁散射光和熒光的信號。
- 放大系統，線性或對數放大。
- 計算機，用於分析信號。
早期的流式細胞儀主要是實驗設備，但目前儀器和相關的試劑有了很廣的市場。不同廠商的儀器特性也不同。
通過流式細胞儀獲取樣本數據的過程叫做「獲取過程」（acquisition）。這個過程是以連接在流式細胞儀的計算機，和處理細胞計數器的軟件為媒介的。其中，軟件可以調節用於檢測樣本的不同參數值，如電壓（voltage），補償（compensation）等，並且在獲取樣本數據時協助樣本信息的數字顯示，以確保參數正確的設置。現代的流式細胞儀很多應用在熒光標記（ fluorescently labeled ）的抗體（antibody）上。
現代流式細胞儀通常擁有多種激光和多種熒光檢測。 最近數據顯示商用流式細胞儀有高達10種激光， 18種熒光檢測器。這個數字的增長可以使得更多的抗體被標記，並且通過表現型標記（ phenotypic markers）識別到可觀的樣本數量。 有些設備甚是可以獲取單個細胞的數字圖像，用於分析熒光在細胞中的具體位置（比如細胞內部，細胞表面等）。
數據分析
[編輯]
補償（compensation）
[編輯]每種熒光染料都具有廣泛的熒光光譜。 當使用多種熒光染料時，可能會發生熒光染料之間的重疊。 這種情況被稱為頻譜重疊。 這種情況需要克服。 例如，FITC和PE的發射光譜是熒光素發射的光在穿過用於PE的濾光片時重疊相同的波長。 通過從PE信號中去除一部分FITC信號來校正該頻譜重疊，反之亦然。 這個過程被稱為色彩補償，它將熒光色素計算為百分比來衡量自身[3]。
圈選（gates）
[編輯]由流式細胞儀得到的數據可以由新的軟體繪製成一維的柱狀圖（histograms）或是二維甚至是三維的點陣圖（dot plots），進一步由所謂的"圈選"（gates）點陣圖的方式，可將點陣圖的點圖區域不斷地作一系列的分離及再分析。而特殊的圈選流程（protocols）對於血液學方面在臨床上的診斷有相當的關連性。
這類點陣圖經常以對數（logarithmic）尺標的方式來呈現。由於螢光染劑彼此會有光譜波長重疊的情形，而螢光波長呈現的訊號常會被來自螢光接受器的訊號所干擾，因此需由電子運算的方式進行螢光補償（compenstation）。從流式細胞儀中獲取到的數據可以通過以下軟件進行分析：e.g., JMP_(statistical_software), WinMDI,[9] Flowing Software,[10] and web-based Cytobank[11] (all freeware), FCS Express （頁面存檔備份，存於網際網路檔案館）, FlowJo, FACSDiva, CytoPaint (aka Paint-A-Gate),[12] VenturiOne, CellQuest Pro, Infinicyt or Cytospec.[13] 一旦數據收集的過程已經結束，流式細胞儀就不用繼續連接在計算機中。後續的數據分析可以在計算機中獨立進行，這一點尤其用在一些高精度需求的儀器上。
計算分析
[編輯]最近在使用計算方法進行自動化群體識別方面的進展為傳統的圈選策略（gating strategies）提供了一種替代方案。 自動識別系統可能有助於發現罕見和隱藏的種群。 代表性的自動化方法包括FLOCK[4]，免疫學數據庫和分析門戶（ImmPort）[5]，Bioconductor中的SamSPECTRAL [6]和flowClust[7][8][9]以及GenePattern中的FLAME[10]。
應用
[編輯]流式細胞術在很多領域中都有應用，包括分子生物學、病理學、免疫學、植物學、和海洋生物學等[11]。在分子生物學中，它主要用於熒光標記的抗體。特異性的抗體與靶細胞上的抗原結合，能夠通過流式細胞儀研究這些細胞的特別信息。這在醫學中具有很廣泛的應用，尤其是在器官移植、血液學、腫瘤免疫學和化療、遺傳學、精子分類（Sperm sorting）、和性別選擇。此外，它廣泛用於檢測DNA損傷[12][13]，半胱氨酸蛋白酶切割和細胞凋亡的研究[14]。 在神經科學中，細胞表面的共表達（co-expression）和細胞外抗原（intracellular antigens）可以被分析[15]。
現代的流式細胞儀具有多個激光和熒光檢測器（目前商業用儀器的記錄是4個激光和14個檢測器），可以用於多個抗體標記，以便在表現型中更準確地區別某個靶群體。
流式細胞儀也是很有用的分選儀器。當細胞/顆粒通過時，可以被選擇性地加上某種電荷，並在通過電磁場後偏轉，從不同出口流出。這樣就可以從一個混合物中高速（理論上可達到每秒大約9萬個細胞）準確地分離開四類細胞。
海洋中主要的光合生物之一——佔海洋浮游生物總細胞數將近1/3的原綠球藻（Prochlorococcus）就是通過流式細胞術發現的。因爲其細胞小，葉綠素含量少，在通常的熒光觀察中被迅速漂白(bleach)，但由於在流式細胞術中細胞通過光束的時間極短，胞內葉綠素的熒光可被觀察到。
參見
[編輯]
參考資料
[編輯]- ^ Ashraf M. Khalil. B Cell Signal Transduction in Germinal Center B Cells is Short-Circuited by Increased Phosphatase Activity. Science. 2012-06-01 [2019-05-11]. （原始內容存檔於2021-05-26）.
- ^ Kerenyi, Marc A; Shao, Zhen; Hsu, Yu-Jung; Guo, Guoji; Luc, Sidinh; O'Brien, Kassandra; Fujiwara, Yuko; Peng, Cong; Nguyen, Minh; Orkin, Stuart H. Histone demethylase Lsd1 represses hematopoietic stem and progenitor cell signatures during blood cell maturation. eLife. 2013-06-18, 2 (2013; 2) [2019-05-11]. PMID 23795291. doi:10.7554/eLife.00633. （原始內容存檔於2019-09-24）.
- ^ Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 2001-11-01, 45 (3): 194–205 [2018-03-31]. ISSN 0196-4763. PMID 11746088. doi:10.1002/1097-0320(20011101)45:3<194::aid-cyto1163>3.0.co;2-c. （原始內容存檔於2019-06-09）.
- ^ Qian Y, Wei C, Eun-Hyung Lee F, Campbell J, Halliley J, Lee JA, Cai J, Kong YM, Sadat E, Thomson E, Dunn P, Seegmiller AC, Karandikar NJ, Tipton CM, Mosmann T, Sanz I, Scheuermann RH. Elucidation of seventeen human peripheral blood B-cell subsets and quantification of the tetanus response using a density-based method for the automated identification of cell populations in multidimensional flow cytometry data. Cytometry Part B. 2010,. 78 Suppl 1: S69. PMC 3084630
. PMID 20839340. doi:10.1002/cyto.b.20554.
- ^ Immunology Database and Analysis Portal. [2009-09-03]. （原始內容存檔於July 26, 2011）.
- ^ Zare H, Shooshtari P, Gupta A, Brinkman RR. Data reduction for spectral clustering to analyze high throughput flow cytometry data. BMC Bioinformatics. 2010, 11: 403. PMC 2923634 . PMID 20667133. doi:10.1186/1471-2105-11-403.
- ^ flowClust. [2009-09-03]. （原始內容存檔於2017-06-13）.
- ^ Lo K, Brinkman RR, Gottardo R. Automated gating of flow cytometry data via robust model-based clustering. Cytometry Part A. 2008, 73 (4): 321–332. PMID 18307272. doi:10.1002/cyto.a.20531.
- ^ Lo, Kenneth; Hahne, Florian; Brinkman, Ryan R.; Gottardo, Raphael. flowClust: a Bioconductor package for automated gating of flow cytometry data. BMC Bioinformatics. 14 May 2009, 10: 145 [2018-03-31]. doi:10.1186/1471-2105-10-145. （原始內容存檔於2019-10-18） –透過BioMed Central.
- ^ FLow analysis with Automated Multivariate Estimation (FLAME). [2009-09-03]. （原始內容存檔於August 21, 2009）.
- ^ Murphy RW, Lowcock LA, Smith C, Darevsky IS, Orlov N, MacCulloch RD, Upton DE. Flow cytometry in biodiversity surveys: methods, utility and constraints. Amphibia-Reptilia. 1997, 18: 1–13. doi:10.1163/156853897x00260.
- ^ Tanaka T, Halicka HD, Huang X, Traganos F, Darzynkiewicz Z. (2006) Constitutive histone H2AX phosphorylation and ATM activation, the reporters of DNA damage by endogenous oxidants. Cell Cycle 5:1940-1945, PMID 16940754
- ^ MacPhail SH, Banáth JP, Yu Y, Chu E, Olive PL.Cell cycle-dependent expression of phosphorylated histone H2AX: reduced expression in unirradiated but not X-irradiated G1-phase cells.Radiat Res. 2003 Jun;159(6):759-67. PMID 12751958
- ^ Darzynkiewicz Z, Juan G, Li X, Gorczyca W, Murakami, M. Traganos F. (1997) Cytometry in cell necrobiology. Analysis of apoptosis and accidental cell death (necrosis). Cytometry 27:1-20, PMID 9000580.
- ^ Menon, Vishal; Thomas, Ria; Ghale, Arun R.; Reinhard, Christina; Pruszak, Jan. Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types. Journal of Visualized Experiments. 2014-12-18, (94) [2018-03-30]. ISSN 1940-087X. PMC 4396953 . PMID 25549236. doi:10.3791/52241. （原始內容存檔於2019-06-17） （英語）.
